1资料与方法 1.1一般资料 收集该院胃肠外科手术标本,包括腺瘤40例、炎症性肠病20例、增生性息肉20例、结直肠癌及其癌旁正常组织80例。以上组织,一份用于RNA的提取,一份做病理检查。病理分期参照第7版UICC/AJCC结直肠癌TNM分期标准。结直肠癌患者:年龄30~90岁,中位年龄60岁,男46例,女34例,肿瘤大小<5cm39例、≥5cm41例;20例高分化、31例中分化、29例低分化;49例发生淋巴结转移、未发生淋巴结转移31例。 1.2试剂与方法 1.2.1试剂人结直肠癌细胞株Colo320DM购买于中国科学院、核酸提取试剂盒(生工),荧光定量PCR试剂盒(大连)。RCAN2mRNA和GAPDHmRNAqPCR特异性扩增引物。MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒,Rcan2-Pcdan3.1,krasG12V-pcdna3.1 1.2.2细胞培养与转染Colo320DM细胞接种于培养瓶中,10%胎牛血清,RPMI-1640培养基,37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱内培养,当细胞密度达到70%~80%时。将细胞接种于6孔板中,分为2组:转染空载组;转染krasG12V-pcdna3.1组。待细胞密度达到70%~80%时,按照试剂说明,将质粒转进细胞,继续培养48h,取出提取mRNA。 1.2.3MTT实验将两组coloDM320细胞株,转入空载Pcdna3.1的对照组和转入Rcan2-Pcdna3.1的阳性克隆组分别培养,按试剂说明收集细胞,将细胞接种于96孔板,37℃、5%CO2培养箱中培养8~24h。去上清,加入新鲜培养基,MTT溶液,于培养箱中继续培养4h。之后去除MTT,并向每孔加入结晶溶解液,将96孔培养板放入酶标仪中,在490nm处检测各孔细胞的吸光值。以时间为横轴,吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线。 1.2.4实时荧光定量PCR检测模板为组织cDNA,GAPDH进行标准化。引物Rcan2基因,上游:5'-CTGAGTCCACCCCAAGTGTC-3',下游:5'-GGACGCCGAGTTTGGATGAT-3';内参GAPDH,上游:5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3',下游:5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。反应条件为:95℃预变性30s,95℃变性5s,56℃退火加延伸30s,共40个循环。记录反应的Ct值。 1.3统计方法 此次研究中所涉及的数据均采用SPSS20.0统计学软件进行分析,计数资料采用百分率(%)表示,并采用χ2检验,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,并采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1Rcan2在结直肠癌组织中高表达 为了研究Rcan2在个组织中的表达情况,该研究收集了炎症性肠病20例、增生性息肉20例、腺瘤40例、结直肠癌及其癌旁正常组织80例,获取样本总RNA,实时荧光定量PCR测定Rcan2mRNA的表达水平,根据各组均值做统计分析。如图1所示,与癌旁正常组织相比,直肠癌组织中Rcan2成高表达(P<0.01)。而在炎症性肠病、腺瘤、增生性息肉、癌旁正常组织中,Rcan2表达较低,且表达量差异无统计学意义(P>0.05),结直肠癌组织中Rcan2mRN4表达量(2.98±0.21)明显高于其他各组(图1)。 2.2RCNA2mRNA表达量与结直肠癌标本临床病理特征的关系 如表1显示,肿瘤大小与结直肠癌组织中Rcan2mRNA表达量显著相关(P<0.01)。Rcan2mRNA的表达量与年龄、性别、分化程度、淋巴节转移无相关(P>0.05)。 2.3Rcan2过表达抑制肿瘤细胞的增值 为了确定Rcan2对肿瘤细胞增值的影响,该研究将Rcan2-pcdna3.1,空载转入colo320DM细胞,培养72h观察。MTT法检测细胞的增殖能力,如图2所示,与空载转染的细胞相比,Rcan2-pcdna3.1转染的细胞增长速度相对较慢,这意味着过表达Rcan2对对细胞的增殖能力起到抑制作用。Rcan2-pcdna3.1转染的细胞增长速度慢,OD值从10上升到14,而pcdna3.1转染的细胞增长速度快,OD值从12上升到18,过表达kras(G12V)抑制Rcan2基因表達。Rcan2相对表达量从2.8下降到1.1。 2.4kras突变抑制Rcan2基因表达 大约40%的结直肠癌存在kras基因的突变,为了解kras突变对Rcan2表达量的影响,该研究将krasG12V-pcdna3.1与空载pcdna3.1分别转染colo320DM细胞。培养48h,提取总RNA。荧光定量pcr检测Rcan2mRNA表达量。如图4所示,与转染krasG12V-pcdna3.1组相比,空载组Rcan2表达量更高(P<0.01),这表明突变kras抑制Rcan2基因表达。 3讨论 在中国结直肠癌作为高危癌种,大约有4%~5%的发病风险,而大约又有1/3的结直肠癌患者死于该疾病[6]。结直肠癌发病机制复杂,目前已有相关的基因途径被报道。譬如Wnt-APC通入,Ras-MAPK通路等[7],mTORC1作为一个重要的蛋白激酶,也与结直肠癌的发生发展密切相关。近期又有相关研究[8-9]报道了Rcan家族与细胞的增值相关,之后研究又报告了Rcan1在肾癌和卵巢癌中血管表达,该研究近期发现家族的另一个成员Rcan2在结直肠癌的肿瘤细胞中表达显著,通过荧光定量PCR检测Rcan2mRNA在结直肠癌,增生性息肉、腺瘤、炎症性肠病及癌旁正常组织中的表达,该研究发现Rcan2的表达水平在结直肠癌组织中高表达且明显高于其他各组。这暗示Rcan2的高表达是结直肠癌的特征之一。此外,该研究又结合临床病理分析,发现高表达的Rcan2mRNA意味着更小体积的肿瘤,随后的MTT的结果进一步说明了上诉的推论。这些结果表明Rcan2抑制肿瘤的增值。
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